1986年导演谢铁骊启动电影《红楼梦》，共六部八集的电影拍摄历时3年，招入了越剧、京剧、吕剧等不同剧种的演员，何赛飞便是其中之一。片中她饰演妙玉，这是她走上银幕的开始。

1994年何赛飞拍摄了李少红执导的电影《红粉》和陈凯歌执导的电影《风月》。在《红粉》中，她饰演青楼女子小萼，演得不温不火、恰当好处，这部影片也进一步提高了她的知名度。

1995年她获得中国电影表演艺术学会奖。1996年她凭借在《敌后武工队》中的表演获得第19届大众电影百花奖最佳女配角奖；同年接拍了电视剧《情系国脉》、《汉口往事》、《昨日留言》。

2000年，她接拍了20集电视剧《爱是阳光》，并在剧中任女主角。2001年，在郭宝昌导演的电视剧《大宅门》中饰演名妓杨九红，凭借在这部电视剧中的表现，何赛飞获得中央电视台美菱杯“观众最喜爱的十佳女演员奖”。

2004年出演电视剧《月影风荷》，饰演季文月一角。2005年加盟上海滑稽剧团。

2007年12月，何赛飞到宁波出演滑稽戏《太太万岁》；同年主演电视剧《江湖兄弟》，剧中何赛飞与施羽出演一对在江湖中飘泊的恋人。

2008年与汤唯、梁朝伟合作出演李安导演的电影《色戒》；饰演萧太太一角。2010年主演电视剧《老马家的幸福往事》。

2011年，主演电视剧《后宫》，剧中何赛飞饰演的明宪宗的生母周太后。2012年，出演电视剧《唐宫燕》，饰演唐中宗李显的妻子韦皇后。

2013年，与佟丽娅 、杨烁合作出演电视剧《刀客家族的女人》；4月，何赛飞主演的电视剧《那金花和她的女婿》在全国各大卫视黄金档播出。2015年，加盟主演抗战片《那些女人》，饰演水芹妈。

2016年，凭借电影《那些女人》获得第三届中澳国际电影节最佳女主角奖。

2018年1月20日，参加“百花迎春——中国文学艺术界2018春节大联欢”。3月5日，参加访谈节目《为时代喝彩》。9月3日，主演的民国风情抗战电影《那些女人》上映。9月29日，凭借《那些女人》获第十六届平壤国际电影节组委会最佳女主角奖。10月5日，何赛飞领衔主演剧戏音乐剧《杨月楼》。

2019年4月1日，参演的电视剧《面具背后》播出。12月31日，参加的戏曲节目《角儿回来了》在央视戏曲频道播出。

2020年1月11日，参加的综艺节目《直通春晚》第六期在央视综艺频道播出。同年，参演电视剧《爱在平凡》。10月26日，主演的电视剧《亲爱的设计师》定档在腾讯视频播出，在剧中饰演李曼丽。12月5日，主演的话剧《雷雨》和《雷雨·后》在海口湾演艺中心首演，在剧中饰演鲁侍萍。12月24日，主演的电视剧《山海蓝图》定档在北京卫视播出。

2021年2月18日，主演的电视剧《甜蜜》定档在CCTV-8、腾讯视频、爱奇艺播出，在剧中饰演蔡冬梅，并获得成功。

2019年4月1日，参演的电视剧《面具背后》播出。12月31日，参加的戏曲节目《角儿回来了》在央视戏曲频道播出。

2020年1月11日，参加的综艺节目《直通春晚》第六期在央视综艺频道播出。同年，参演电视剧《爱在平凡》。10月26日，主演的电视剧《亲爱的设计师》定档在腾讯视频播出，在剧中饰演李曼丽。12月5日，主演的话剧《雷雨》和《雷雨·后》在海口湾演艺中心首演，在剧中饰演鲁侍萍。12月24日，主演的电视剧《山海蓝图》定档在北京卫视播出。

2021年2月18日，主演的电视剧《甜蜜》定档在CCTV-8、腾讯视频、爱奇艺播出，在剧中饰演蔡冬梅，并获得成功。