NGS可作为FISH检测HER2扩增的替代方法—纪念斯隆·凯特琳癌症中心的结论
人类表皮生长因子受体2（HER2）基因，即ERBB2基因，是定位于人类17号染色体（Chr17）长臂（17q12）上的原癌基因。HER2基因发生扩增通常会导致HER2蛋白的过度表达。HER2基因扩增导致癌症具有高度侵袭性，是患者预后不良的重要指标，常发生于乳腺癌、胃癌、肺癌等癌症中。目前，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等抗HER2靶向药物可以有效地治疗HER2扩增的肿瘤患者。因此，准确评估HER2状态对于肿瘤患者准确的预后和治疗信息至关重要。
临床上HER2扩增的检测方法主要有免疫组化法（IHC）、荧光原位杂交法（FISH）等。不同的检测方法、计算的准确性和试剂的选择都会影响HER2的检测结果。对于IHC评估为2+的结果，指南推荐需用FISH方法学确认。同样，对于HER2 FISH结果，美国临床肿瘤学会和美国病理学家学院（ASCO/CAP）2013版指南也分为阴性、阳性和不明确三大类。随后ASCO/CAP 2018版指南解决2013版HER2 FISH检测不明确的问题，将HER2 FISH扩增划分为5个组别，分别评估[1]。
2018 ASCO/CAP指南标准针对HER2 FISH的结果判定
鉴于分子诊断技术的不断进步，下一代测序（NGS）技术能够同时检测基因扩增和突变，进而对患者更好地分类管理。为探究在IHC评估HER2扩增不确定的样本，用NGS分析的准确性，2021年发表在Histopathology（IF=5.087）上的一篇回顾性研究进行了分析[2]。
该研究搜集了纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）自2009年1月1日至2019年9月30日期间，经IHC平台检测ERBB2表达且结果不明确（2+或1+至2+）的浸润性乳腺癌病例，回顾了同一组织样本的FISH和NGS检测（MSK-IMPACT）数据，分析比较三种平台的检测结果。对于2018年ASCO/CAP指南之前检测的病例，HER2 FISH结果依据指南重分为5组，并且对第2、3、4组样本重新进行FISH检测分析。NGS测序基于MSK-IMPACT产品检测486个癌症相关基因不同突变类型。考虑到拷贝数检测结果会受到肿瘤细胞占比等因素的影响，参考ROSS等人研究结论，将ERBB2基因扩增倍数≥2.0定义为基因扩增，将1.5≤扩增倍数≤2.0且P值＜0.05定义为拷贝数增加（灵敏度95%，特异性100%）[3]。
研究结果
研究分析了来自51名乳腺癌患者的52份FISH和NGS结果，所有患者HER2 IHC结果均为不确定。患者的临床和病理结果见表1。参考2018年ASCO/CAP HER2检测指南，对51名患者FISH结果重新分类，第1-5组的患者数目分别是：8例（15.4%）、3例（5.8%）、3例（5.8%）、14例（26.9%）和24例（46.2%）。患者初诊年龄、病理分期等临床因素均无显著性差异。在对患者进行20.9个月的中位随访中，第4组的14名患者中有2名在最后一次临床随访时去世，其余健在。
表1.来自51例患者的52份样本的乳腺癌临床和病理特征
ERBB2扩增状态—NGS和FISH方法比较分析
针对NGS和FISH检测ERBB2扩增结果（表2），第1组至第5组样本中NGS检出为ERBB2扩增/拷贝数增加的数目为：8例（8/8; 100%）、2例（2/3; 66.7%） ,1例（1/3; 33.3%）,1例（1/14；7.1%）和0例（0/24; 0%）。在这些样本中，第1组5例NGS检出ERBB2拷贝数增加，3例检出扩增。第2组的2例分别检出扩增和拷贝数增加。第3组1例检出ERBB2扩增。第4组1例检出ERBB2拷贝数增加（NGS、IHC、FISH检测结果见图1）。
表2.分析比较NGS和FISH方法学检测ERBB2扩增结果
图1
针对第4组样本的分析（表3），在NGS检出HER2未扩增的5例样本中，对来自同一样本（n=3）或不同样本（n=2）的HER2 FISH检测结果都归类为第4组。有1例NGS结果为阴性的样本的两块组织，FISH结果分别归于第4组和第5组。然而，有1例患者FISH检测原发灶样本结果为第1组（阳性），NGS提示拷贝数增加，而之前归类为第4组的标本来源是转移性肝病灶，推测是由于肿瘤原发灶和转移灶间的异质性导致。总体来说，FISH检测为第4组的样本与NGS检测及新样本检测为阴性的结果高度一致。
第2组的3个样本中，HER2 FISH结果来自于不同肿瘤样本，2例归类为第1组阳性，另1例样本经NGS检出未扩增而FISH结果一致分类为第5组阴性，且FISH结果与NGS结果一致。第3组的2个病例中，1例样本NGS未检出扩增且HER2 FISH 结果分类为第 5 组，检测结果一致。而另1例患者，原发灶样本通过NGS检出扩增，而转移灶经过FISH检出结果分类为第5组阴性。根据原发灶FISH结果（第3组，阳性），患者接受了HER2靶向治疗，但在多线化疗后最终死于转移性疾病。表明在经过重新检测的样本中，NGS和FISH两种平台对患者ERBB2扩增状态的一致性比较高。
NGS突变分析揭示拷贝数变化差异
NGS平台检测范围同时覆盖了基因扩增和体细胞突变，图2为第1、4和5组病例中检出情况。与第4组相比，在单变量分析中，ERBB2基因扩增检测结果与第1组的拷贝数变化显著相关（p=0.01）。RARA基因扩增和第1组的拷贝数变化也存在显着相关性（P=0.04）。研究表明，在第1组和第4组所有携带RARA基因扩增的5例样本中，均伴随ERBB2扩增。而在第4组和第5组的体细胞突变或拷贝数变化之间没有显着差异。
2018年ASCO/CAP第4组患者的HER2靶向治疗
在第4组的14名乳腺癌患者中，4名（28.6%）患者接受了抗HER2靶向治疗。其中1名患者为新辅助和辅助治疗，该患者为35岁转移性乳腺癌肝转移患者，IHC结果为2+，肝脏病灶FISH验证结果为HER2扩增，患者随即接受了多西他赛、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等新辅助治疗。值得注意的是，在本研究中对肝结节的同一组织样本的HER2 FISH结果仍然归类为第 4 组（HER2 /CEP17=1.6，平均HER2拷贝数为5.2）。患者随后接受了乳房切除术，结果表明对新辅助化疗反应极小。研究对乳腺术后病灶FISH检测结果为第1组（HER2/CEP17=2.7，平均HER2拷贝数为5.5）。而对第4组其余10名未接受HER2靶向治疗的患者进行17个月的中位随访中，有9名（90.0%）在初始治疗后保持无病生存。
ASCO/CAP ISH第1、4/5组的乳腺癌病例中，通过NGS检出的体细胞突变和拷贝数改变。
总结讨论
在这项针对HER2 IHC 结果不确定的浸润性乳腺癌的回顾性单研究中，分析总结了基于2018年ASCO/CAP指南的FISH检测结果与NGS技术检测ERBB2拷贝数的相关性。研究发现，ASCO/CAP指南纳入到第4组的14例样本中有13例（92.9%）经FISH和NGS评估ERBB2为未扩增。另外1例患者的肝转移病灶FISH检测为未扩增，但NGS检出ERBB2拷贝数增加；随后对患者原发灶FISH检测为HER2扩增，归类为2018ASCO/CAP ISH第1组，与NGS结果一致。由于研究中FISH和NGS检测样本为相同的组织块，所以肿瘤内异质性还不足以解释结果不一致。这例不一致的HER2 FISH结果来源于样本中低水平的扩增，导致NGS检出ERBB2拷贝数增加，这可能是导致结果不一致的原因。这同时也说明了，针对HER2低水平扩增的样本，FISH检测结果的不确定性。
研究通过NGS检出56%（5/9）的样本同时发生ERBB2扩增与RARA扩增。而RARA基因在染色体上与ERBB2基因相邻，表明两者的扩增具有显著关联性。而且，前期有两项研究中也分别在71%（5/7）和71%（10/14）的HER2扩增的样本中检出RARA扩增（FISH法）。同时，本研究发现ASCO/CAP指南标准分类的第1组和第4组之间，NGS检出的ERBB2以及RARA基因的拷贝数变化存在显着差异。因此，RARA基因扩增也可用作HER2 FISH结果不确定的替代检出指标（ASCO/CAP指南暂未推荐）。
关于HER2靶向治疗，研究显示在第4组患者中，NGS检出超过90%的患者经验证为HER2未扩增，这些患者并未接受HER2靶向治疗并且持续无病生存，而在少数接受抗HER2治疗的第4组患者中，2例患者获益1例患者疾病进展。所以2018年ASCO/CAP指南并不推荐归类为第4组患者使用抗HER2靶向治疗。
同Ross 等人研究结果一致，本研究结果支持将NGS作为FISH检测HER2扩增的替代方案。事实上，与FISH方法学相比，NGS不仅可以准确检测ERBB2扩增同时提供丰富的基因突变信息，具有更广泛的指导意义，但受限于检测周期较长。至于检测结果，FISH技术因不同抗体间敏感性以及不同观察者间判读标准的差异性也影响着FISH的准确性。该研究虽然存在些许局限性，比如样本量较少，回顾性而非前瞻性研究的限制及样本选择的不统一导致的异质性干扰，但针对于ASCO/CAP HER2 FISH第1、4和5组样本的综合分析，表明NGS测序对于IHC结果不确定的HER2检测具有拷贝数评估客观的优势，还能够准确地靶向治疗获益的患者。例如，NGS能够检出IHC和FISH都无法检出的HER2扩增，当然这种情况比较罕见。而在常见的ASCO/CAP指南第4组乳腺癌患者中，NGS能够将该组患者确认为HER2 FISH阴性，支持其从2013版指南中HER2 FISH不确定组重新分类为2018版HER2阴性，表明在评估乳腺癌患者HER2拷贝数时，采用NGS方法是可以辅助判定FISH /IHC检测结果不明确的样本，从而提高临床诊断效率及临床诊断准确性。
参考文献：
[1] Wolff AC, Hammond MEH, Allison KH, Harvey BE, Mangu PB, Bartlett JMS, Bilous M, Ellis IO, Fitzgibbons P, Hanna W, Jenkins RB, Press MF, Spears PA, Vance GH, Viale G, McShane LM, Dowsett M. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Clinical Practice Guideline Focused Update. J Clin Oncol. 2018 Jul 10;36(20):2105-2122.
[2] Hoda RS, Bowman AS, Zehir A, Razavi P, Brogi E, Ladanyi M, Arcila ME, Wen HY, Ross DS. Next-generation assessment of human epidermal growth factor receptor 2 gene (ERBB2) amplification status in invasive breast carcinoma: a focus on Group 4 by use of the 2018 American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists HER2 testing guideline. Histopathology. 2021 Mar;78(4):498-507.
[3] Otsuji K, Sasaki T, Tanabe M, Seto Y. Quantitative assessment of HER2 gene amplification of breast cancer using droplet digital PCR. Pathol Int. 2021 Aug;71(8):538-547. 返回搜狐，查看更多
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