基于傅里叶变换红外吸收光谱的微生物分型分析方法与流程

本发明涉及一种微生物分型分析方法，特别涉及一种基于傅里叶变换红外吸收光谱多糖所在波数范围900-1200cm^-1的微生物分型分析方法。

背景技术：

人类历史上曾发生过多次由细菌引起的死亡灾难，谈及细菌，人们唯恐避之而不及。当下医药卫生领域也是投入了大量的精力防止病人受到周围环境中细菌特别是耐药性细菌的的侵袭引发二次感染。但这只是细菌的在人类文化中的冰山一角，在我们不曾注意的角落细菌正循环利用地球上的元素以此为其他的生物提供营养支持；并为我们清理垃圾，参与气候的调节与水质净化；甚至是空中漂浮的云朵的形成都与微生物息息相关。通过各种技术手段微生物，并与之建立联系。对人类未来的发展是极为重要的。

红外光谱用于微生物分型由来已久，从1800年威廉·赫歇尔用棱镜使太阳光发生色散，就意识到了红外光的存在。在其后一百年就有科学家将红外光谱用于上百种有机和无机化合物的分析。直到1957年第一台商业化红外光谱仪的出现以及1966年约瑟夫·傅里叶提出的傅里叶变换算法才成就了现在我们所见到的傅里叶变换红外光谱。而红外光谱用于细菌的鉴定开始于十九世纪九十年代。有科学家提出，每一个微生物个体在红外光谱中都有与其对应的特征谱，可用于微生物的区分和鉴定。从那以后关于红外光谱对微生物进行不同分类学水平上分型的研究层出不穷。

红外吸收光谱的测试大致可以分为两种模式：透射模式和反射模式。

通过红外光诱导共价键产生振动，其包含伸缩振动和弯曲振动两大类，从而产生特异性的振动频率即为化学键的特征。而不同的生物材料则是由于其含有的化学键的不同，表现为在红外吸收光谱中不同的外置的特征吸收。

不同的生物材料在红外吸收光谱中所对应的波数范围：脂类为3000-2800；蛋白质酰胺i带和酰胺ii带为1700-1500；磷脂类、dna、rna为1500-1185、多糖为1185-900以及900-600的尚未被识别的指纹区。

红外吸收光谱用于微生物的鉴定普遍需要对谱图进行前处理，提取出最具有分析对象特征的信息，这也是决定分型效果最关键的部分。最后再以层次聚类分析、主成分分析、划块聚类分析等化学计量学的方法展现分型效果。

传统的微生物红外光谱分析中都会将蛋白质红外吸收所在的区域1800-1230cm^-1包含其中，导致分型准确度不高。

技术实现要素：

为了克服上述红外光谱分型中存在的缺点，本发明提供一种基于傅里叶变换红外吸收光谱的微生物分型分析方法，选择在多糖所在的波数范围900-1200cm^-1进行分析，进而对微生物准确分型。

进一步，所述分析方法将充分去除培养基的细菌悬浊液涂布在氟化钙晶片上，置于烘箱中，待样品悬浊液烘干后，进行红外吸收光谱的收集，将所得到的谱图进行基线调整、滤波器拟合平滑、一阶导数和二阶导数的获取、有效值严重缺失谱图的剔除、数据归一化、数据的对数转化后进行聚类分析。

进一步，菌种复苏后，挑选单菌落于lb肉汤培养基中37℃恒温摇床，进行培养得到细菌混合物，去除培养基后得到细菌悬浊液。该细菌培养方法无任何特异性，仅要求适合细菌生长且在整个鉴定过程中尽量保证培养条件的一致性，以减少培养方式不同带来未知因素的干扰。

培养好细菌后，具体制样步骤为：

(1)取1毫升菌液，高速离心机以每分钟10000转的转速，离心2分钟，去除培养基；

(2)用0.9％的氯化钠溶液清洗细菌三次，每次1毫升。

(3)用170微升0.9％的氯化钠溶液重悬。

(4)用移液枪取50微升涂布于氟化钙晶片上，置于45℃烘箱中，持续干燥30分钟。细菌悬浊液就会在晶片表面形成一层薄膜，而固定在晶片上。

(5)将晶片固定在红外光谱仪上，即可进行红外光谱的收集。

该制样方法无任何特异性，只需在制样过程保证培养基去除干净以减小培养基的干扰；保证细菌悬浊液能形成固定在晶片表面的固体薄膜即可。

进一步，细菌悬浊液涂布在氟化钙晶片后，烘干，细菌悬浊液在晶片表面形成一层薄膜，固定在晶片上。

进一步，红外吸收谱图收集时光源选择近红外光，扫描波数范围为500-4000cm^-1，谱图分辨率为4cm^-1，扫描循环数为62，扫描速度为21次每分钟。

进一步，所述基线调整为：利用数据软件在全谱范围进行背景扣除，然后截取波数范围900-4000cm^-1进行基线调整，将谱图两端调零，同时将将波数范围1800-2800cm^-1采用分段式调至与零位齐平。

进一步，基线调整后的谱图，对单一谱图采用滤波器拟合平滑，得到原始谱图的一阶导数和二阶导数谱图；然后对所有谱图进行质量筛选，若谱图有效数值缺失比例大于百分之五十，则将该张单一谱移除，而剩余谱图中若出现数值缺失，则用原始数据中最小值的一半代替；处理后的数据，再用四分位间距对数据进行过滤；然后进行分位数归一化处理，同时将数据做对数转化；对处理好的数据，进行划层次聚类分析，达到鉴定和分型的目的。

进一步，所述划层次聚类为凝聚型层次聚类，先将每个对象视为一个簇，然后以欧氏距离为依据将距离最小的两个簇合并成一个新簇，然后重新计算新簇间的距离，间距离最小的两个簇合并成一个簇，循环直到所有对象都在一个簇中。

进一步，所述分析方法选择在多糖所在的波数范围900-1185cm^-1进行分析，进而对微生物分型。

本发明提供了微生物的培养方法以及微生物红外吸收光谱，特别是对于谱图的前处理及有效信息的提取。本发明的分析方法依赖于微生物完整菌落的光谱测量，而非提取微生物的成分进行测量。

本发明所使用的红外吸收光谱收集的仪器为美国biotools公司的pr0ta-2x系列prota蛋白质分析仪。主要组件包括：abbbomemmb3000傅立叶变换红外光谱仪，可拆卸氟化钙样品池(abbbomeninc.)，配套的集成谱图收集、数据处理软件grams/al以及基于此软件的prota软件。

其中上样装置是可拆卸的氟化钙样品池，包括一片氟化钙晶片，垫片和固定装置。

与现有技术相比，本发明具有如下区别技术特征：

本文公开了一种用微生物红外吸收光谱截断进行微生物鉴定分型的分析方法，即在傅里叶变换红外光谱中选择多糖所在的波数范围(900-1200cm^-1)进行分析而达到微生物分型目的。在谱图用于聚类分析前进行一系列的前处理，其包括：基线调整、savitzky-golay滤波器拟合平滑、一阶导数和二阶导数的获取、有效值严重缺失(缺失比例大于百分之五十)谱图的剔除、数据归一化、数据的对数转化。经过一系列前处理的谱图有效信号得以放大，噪音降低，从而实现了在微生物亚种级别的有效区分。

由于蛋白质是微生物细胞干重中最主要的成分，所以在传统的微生物红外光谱分析中都会将蛋白质红外吸收所在的区域1800-1230cm^-1包含其中，而选择波数范围1800-900cm^-1做为分析对象。事实上，蛋白质红外吸收所在的区域与水分的红外吸收有很大程度的重叠，所以本发明中将该波数范围也剔除了，如此虽然缺失了蛋白质的信号，却将信号基数大幅减小，客观上放大了吸收光谱的差异，从而得到更好的鉴定准确率。

由于空气及水分在波数范围900-1200cm^-1是没有吸收的，所以在谱图的前处理中提取多糖所在的波数范围，可将红外吸收光谱收集过程中的空气及水分的干扰排除在外，得到更具有微生物个体特征的红外吸收光谱图，光谱差异得以突显。

进一步，采用滤波器拟合平滑将微生物红外吸收光谱进行一阶导数及二阶导数的转化，可以有效地提高了信噪，但不建议进行更高阶的求导，因为在信噪比提高的同时谱图也会逐渐失真。

附图说明

图1是二氧化碳(红色)、水(黑色)和微生物(蓝色)红外吸收光谱图。

图2是微生物红外吸收光谱一阶导数谱图。

图3是微生物红外吸收光谱二阶导数谱图。

图4是实施例1中选择选择用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-4000cm^-1)对十株大肠埃希氏菌层次聚类的系统树图。

图5是实施例1中选择用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-1200cm^-1)对十株大肠埃希氏菌层次聚类的系统树图。

图6是利用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-1200cm^-1)对十株大肠埃希氏菌层次聚类的热图。

图7是利用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-1200cm^-1)对八株临床大肠埃希氏菌层次聚类的系统树图。

图8是利用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-1200cm^-1)对九株肺炎克雷伯氏菌层次聚类的系统树图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

实施例1

细菌样本：大肠埃希氏菌cicc10389、肠致病性大肠埃希氏菌cicc10663、致泻大肠埃希氏菌cicc10411、产肠毒素大肠埃希氏菌cicc10413、肠致病性大肠埃希氏菌cicc21531、出血性大肠埃希氏杆菌cicc21530、大肠埃希氏菌cicc20052、志贺毒性大肠埃希氏菌cicc10668、致病性大肠埃希氏菌cicc10372、肠侵袭性大肠埃希氏菌cicc10661

具体步骤：

1.将冻存于-80℃的菌种经胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tsa)于37℃恒温箱培养16个小时。

2.在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tsa)上，用接种环挑取单菌落到装有20毫升lb肉汤培养的50毫升离心管中，在37℃的恒温摇床中培养12小时，摇床转速为170转每分钟。

3.取1毫升菌液于1.5毫升离心管中，用高速离心机以每分钟10000转的转速离心2分钟去除培养基。

4.用1毫升配制好的0.9％的氯化钠溶液将细菌重悬，用高速离心机以每分钟10000转的转速离心2分钟去除氯化钠溶液，重复三次。最后用170微升0.9％的氯化钠溶液将细菌重悬。

5.取50微升细菌重悬液，涂在氟化钙晶片上，铺展成约一平方厘米大小，置于45℃烘箱中，持续干燥30分钟。使菌液在晶片表面形成固体薄膜，从而固定在晶片上。

6.打开红外光谱仪设置谱图收集基本参数：扫描波数范围为500-4000cm^-1，分辨率为4cm^-1，扫描循环数为62，扫描速度为21次每分钟。开始收集空气红外吸收光谱和缓冲液红外吸收光谱。

7.在收集细菌样本的红外吸收光谱时通过调节样品池固定装置，在约一平方厘米大小的菌斑上平行选取五个点。

8.对收集到的谱图进行空气及缓冲液背景吸收的扣除

9.对谱图进行基线调整：将谱图两端调至零位，同时将将波数范围1800-2800cm^-1采用分段式调至与零位齐平。

10.用savitzky-golay拟合平滑，平滑点数为7，分别得到一阶导数和二阶导数。

11.将光谱文件转化为数据列表，截取波数范围900-1200cm^-1，导入数据处理网站(http://www.metaboanalyst.ca)

12.将有效数据缺失比例大于百分之五十的谱图剔除，剩余的谱图中若还有数据缺失，则用原始数据最小值的一半填补。

13.对谱图数据进行四分位数归一化和对数转化。

14.通过欧氏距离，ward聚类算法进行层次聚类。

图4是实施例1中选择选择用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-4000cm^-1)对十株大肠埃希氏菌层次聚类的系统树图，可知，选择用原始谱图波数范900-4000cm^-1进行hca聚类分析结果正确率仅为40％。

图5是实施例1中选择用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-1200cm^-1)对十株大肠埃希氏菌层次聚类的系统树图。可以发现当其余条件一致，当用波数范围1200-900cm^-1的二阶导数谱图进行hca聚类时，聚类的正确率就得到了大幅的提升，到达100％。

图6是利用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-1200cm^-1)对十株大肠埃希氏菌层次聚类的热图。

图7是利用红外吸收光谱二阶导数谱图(波数范围900-1200cm^-1)对八株临床大肠埃希氏菌层次聚类的系统树图。

表一比较了选择不同波段微生物红外谱图在不同数学处理方式下对十株大肠埃希氏菌层次聚类分析的结果。

表一、不同谱图处理方式对十株大肠埃希氏菌层次聚类分析的正确率比较

由于不同的生物材料有其特有的红外吸收波段：脂类为3000-2800；蛋白质酰胺i带和酰胺ii带为1700-1500cm^-1；磷脂类、dna、rna为1500-1185cm^-1、多糖为1185-900cm^-1。以此为标准对全谱进行截取，从表格一可以看出，随着信号波段的截取，聚类的正确率逐渐升高；同时，相比于原始谱图，在相同的波数范围中，一阶导数谱图的聚类正确率会更高一些。

实施例2八株临床大肠埃希氏菌的聚类分析

细菌样本：大肠埃希氏菌17032308、大肠埃希氏菌17032604、大肠埃希氏菌17032605、大肠埃希氏菌17032519、大肠埃希氏菌17032511、大肠埃希氏菌17032404、大肠埃希氏菌17032601(以上为医院内部编号)、大肠埃希氏菌cicc20052

具体步骤：

将冻存于-80℃的菌种经胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tsa)于37℃恒温箱培养16个小时。

在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tsa)上，用接种环挑取单菌落到装有20毫升lb肉汤培养的50毫升离心管中，在37℃的恒温摇床中培养12小时，摇床转速为170转每分钟。

取1毫升菌液于1.5毫升离心管中，用高速离心机以每分钟10000转的转速离心2分钟去除培养基。

用1毫升配制好的0.9％的氯化钠溶液将细菌重悬，用高速离心机以每分钟10000转的转速离心2分钟去除氯化钠溶液，重复三次。最后用170微升0.9％的氯化钠溶液将细菌重悬。

取50微升细菌重悬液，涂在氟化钙晶片上，铺展成约一平方厘米大小，置于45℃烘箱中，持续干燥30分钟。使菌液在晶片表面形成固体薄膜，从而固定在晶片上。

打开红外光谱仪设置谱图收集基本参数：扫描波数范围为500-4000cm-1，分辨率为4cm-1，扫描循环数为62，扫描速度为21次每分钟。开始收集空气红外吸收光谱和缓冲液红外吸收光谱。

在收集细菌样本的红外吸收光谱时通过调节样品池固定装置，在约一平方厘米大小的菌斑上平行选取六个点。

对收集到的谱图进行空气及缓冲液背景吸收的扣除

对谱图进行基线调整：将谱图两端调至零位，同时将将波数范围1800-2800cm-1采用分段式调至与零位齐平。

用savitzky-golay拟合平滑，平滑点数为7，分别得到一阶导数和二阶导数。

将光谱文件转化为数据列表，截取波数范围900-1200cm-1，导入数据处理网站(http://www.metaboanalyst.ca)

将有效数据缺失比例大于百分之五十的谱图剔除，剩余的谱图中若还有数据缺失，则用原始数据最小值的一半填补。

对谱图数据进行四分位数归一化和对数转化。

通过欧氏距离，ward聚类算法进行层次聚类分析。

表二比较了不同谱图处理方式对八株临床大肠埃希氏菌层次聚类分析的正确率差异，结果为截取波数范围900-1200cm^-1进行二阶求导的分型效果最佳。

表二、不同谱图处理方式对八株临床大肠埃希氏菌层次聚类分析的正确率比较

实施例3：九株肺炎克雷伯氏菌的聚类分析

细菌样本：肺炎克雷伯氏菌cicc21519、肺炎克雷伯氏菌cicc21611、肺炎克雷伯氏菌cicc21092、肺炎克雷伯氏菌cicc20093、肺炎克雷伯氏菌cicc22914、肺炎克雷伯氏菌cicc10493、肺炎克雷伯氏菌cicc10781、肺炎克雷伯氏菌cicc10870、肺炎克雷伯氏菌cicc10781

具体步骤：

1.将冻存于-80℃的菌种经胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tsa)于37℃恒温箱培养16个小时。

2.在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tsa)上，用接种环挑取单菌落到装有20毫升lb肉汤培养的50毫升离心管中，在37℃的恒温摇床中培养12小时，摇床转速为170转每分钟。

3.取1毫升菌液于1.5毫升离心管中，用高速离心机以每分钟10000转的转速离心2分钟去除培养基。

4.用1毫升配制好的0.9％的氯化钠溶液将细菌重悬，用高速离心机以每分钟10000转的转速离心2分钟去除氯化钠溶液，重复三次。最后用170微升0.9％的氯化钠溶液将细菌重悬。

5.取50微升细菌重悬液，涂在氟化钙晶片上，铺展成约一平方厘米大小，置于45℃烘箱中，持续干燥30分钟。使菌液在晶片表面形成固体薄膜，从而固定在晶片上。

6.打开红外光谱仪设置谱图收集基本参数：扫描波数范围为500-4000cm^-1，分辨率为4cm^-1，扫描循环数为62，扫描速度为21次每分钟。开始收集空气红外吸收光谱和缓冲液红外吸收光谱。

7.在收集细菌样本的红外吸收光谱时通过调节样品池固定装置，在约一平方厘米大小的菌斑上平行选取五个点。

8.对收集到的谱图进行空气及缓冲液背景吸收的扣除

9.对谱图进行基线调整：将谱图两端调至零位，同时将将波数范围1800-2800cm^-1采用分段式调至与零位齐平。

10.用savitzky-golay拟合平滑，平滑点数为7，分别得到一阶导数和二阶导数。

11.将光谱文件转化为数据列表，截取波数范围900-1200cm^-1，导入数据处理网站(http://www.metaboanalyst.ca)

12.将有效数据缺失比例大于百分之五十的谱图剔除，剩余的谱图中若还有数据缺失，则用原始数据最小值的一半填补。

13.对谱图数据进行四分位数归一化和对数转化。

14.通过欧氏距离，ward聚类算法进行层次聚类。

表三比较了不同谱图处理方式对九株肺炎克雷伯氏菌层次聚类分析的正确率。

表三、不同谱图处理方式对九株肺炎克雷伯氏菌层次聚类分析的正确率比较

本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。