第 4 章 抗菌药物敏感性试验和细菌耐药机制
不同病原菌对不同抗菌药物的敏感性不同,同一 种细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性亦有差 异,因此药物敏感性试验结果的正确与否与临床疗 效的关系极为密切。一个正确的药物敏感性试验结 果,可供临床医师选用抗菌药物时参考,并可提高疗效。
测定抗感染药物在体外对病原微生物有无抑 菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验 (antimicrobial susceptibility testing. AST).简称药敏 试验。
抑菌试验方法主要有定性测定的纸片扩散法 (disk diffusion method, Kirby-Bauer method)、半定量测定的稀释法(dilution method)和E试验(E-test)。
一、纸片扩散法
(一)基本原理
将浸有抗菌药的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板 上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不 断地由纸片中心向四周扩散,形成递减的梯度浓度， 在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制,从 而产生透明的抑菌圈。抑菌圈直径的大小反映待测 菌对抗菌药物的敏感程度,并与该药对待检菌的最低 抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)呈 负相关,即抑菌圈愈大,MIC值愈小。
(二)试验方法
(1)挑取培养18~24h的纯培养菌落4~5个 (图4-1-1A),制备成0.5麦氏单位标准的菌悬液(图 4-1-1B)。
(2)用无菌生理盐水或MH肉汤校正菌液浊度， 使其与标准比浊管的浓度相同(图4-1-1C),在15min 内完成接种。
(3)用无菌棉拭蘸取校正过的菌液,在试管壁上 挤压几次,压去多余的菌液,涂布整个MH平板表面， 再重复2次,每次旋转平板60°,使整个平板涂布均匀 (图4-1-1D),最后用棉拭涂布平板四周边缘。
(4)涂布菌液的平板于室温中干燥3~5min后， 用纸片分配器或无菌镊子镊取药敏纸片，贴于平板表 面,并用镊尖轻压一下纸片使其贴平。每张纸片的间 距不小于24mm,纸片的中心距平板的边缘不小于 15mm,90mm直径的平板宜贴6张药敏纸片(图4- 1-1E)。贴完纸片后,应在15min内将平板反转。
(5)将贴好纸片的平板置35。C孵育18~24h 后,用卡尺量取抑菌圈直径(图4-1-1F)。个别菌孵育 温度、时间及条件应按照美国临床和实验室标准化协 会(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI)的 规定。
(三)结果判断
根据CLSIM100最新标准将所测抑菌圈的大小 报告为敏感(susceptible, S)、中度敏感(intermediate, I)或耐药(resistant，R)。“敏感”是指当一种细菌引 起的感染用某种药物的常规量时治疗有效,这种细菌 即对该药高度敏感,即常规用药时达到的平均血药浓 度为该细菌MIC值的5倍或以上。“中度敏感”是指 当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药物时有效， 或者细菌处于体内抗菌药物浓缩的部位或体液(如 尿、胆汁、肠腔等)中时才被抑制,这种细菌对该药仅 呈中度敏感。通常用药时达到的平均血药浓度一般 相当于或略高于对细菌的MIC值。对于毒性较小的 药物,可适当加大剂量获得临床疗效。“耐药”是指药 物对某一细菌的MIC值高于药物在血液或体液内可 能达到的浓度,或有时细菌能产生灭活抗菌药物的 酶,则不论其MIC值大小如何,仍应判定该菌耐药。 例如产青霉素酶的金黄色葡萄球菌对青霉素耐药。
(四)对某些细菌抑菌圈的判读有特殊要求
(1)检测葡萄球菌或肠球菌对苯唑西林和万古 霉素的抑菌圈需要用透射光(将平板对着光线)。在 苯唑西林纸片(葡萄球菌)或万古霉素纸片(肠球菌) 周围的抑菌圈内有任何明显的菌落或生长薄膜(包括 针尖样菌落)则提示耐药。
（2)如抑菌圈内有独立生长的菌落,则提示可能 有杂菌,需重新分离鉴定;若为高频突变耐药株,尚需 进行药敏试验。
（3）变形杆菌属可蔓延到某些抗生素的抑菌圈 内,所以在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长可忽略 不计(图4-1-2)。
(4)某些细菌的磺胺类药抑菌圈内可能有微量 的细菌生长,可忽略不计,应以外圈为准。
(5)对于溶血性细菌如链球菌,应测量细菌生长 受抑制区域而不是溶血区域
(6)对于产色素的细菌,亦须注意测量细菌生长 受抑制的区域，
二、稀释法 Dlution methed
稀释法药敏试验因其采用的介质不同可分为液 体稀释法和琼脂稀释法,又可因所用的容器不同分为 试管稀释法和微量稀释法,前者使用无菌的13mmX 100mm试管,每一浓度抗菌药物的量至少为1ml;后 者使用8排X12排的U形底小孔的微量稀释板,小 孔内装有0.1ml肉汤。琼脂稀释法又因在平板中进 行而称为平板稀释法。微量稀释法的优点为试剂材 料较节省,而且微量板中可预先配制好抗菌药和培养 基,冷藏后一定时期内使用,较为方便。与试管稀释 法相比,琼脂稀释法配合多点接种器使用,可同时进 行大量菌株的药敏试验,缺点是不能进行最低杀菌浓 度(minimal bactericidal concentration, MBC)的测定。
(一)基本原理
在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列(对倍) 稀释后,定量接种受试菌，35“C过夜孵育后判断结 果。受试菌肉眼未见生长的最低药物浓度,即为该药 物的最低抑菌浓度。
(二)试验方法
1.试管稀释法 取无菌试管24支,排成两排。 另取3支试管,分别作为肉汤对照管、受试菌生长对 照管和质控菌生长对照管。每管加人MH肉汤2ml, 在第1管加入经MH肉汤稀释的药物原液(256mg/L) 2ml,混匀,然后吸取2ml至第2管,混匀后再吸取 2ml至第3管。如此连续对倍稀释至第13管,并从 第13管中吸取2ml弃去。此时各管含药浓度依次为 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、 0.0625mg/L。第1排试管每管加入受试菌菌液0.1ml (菌液浓度为1X10CFU/ml),第2排试管每管加入 标准菌菌液0.1ml(菌液浓度为1X10'CFU/ml),最 终接种菌量约为5X10'CFU/ml。置35C培养箱中 孵育18~24h后观察结果。
2.琼脂稀释法①取无菌平板14个,12个为一 列,另外2个分别作为无菌对照和细菌生长对照。在12个一列的平板上分别标上药物名称和浓度,如第 一个平板为阿米卡星,浓度为128mg/L,第二个平板 为阿米卡星,浓度为64mg/L,第三个平板为阿米卡 星,浓度为32mg/L,依次类推,直至最后一个平板上 的标记为阿米卡星,浓度为0.0625mg/L。然后在浓 度为128mg/L的平板上加人抗菌药母液1ml(浓度 为1920mg/L),在浓度为64mg/L的平板上加入抗 菌药母液1ml(浓度为960mg/L),以下类推直至最 后一块平板。在每块平板中加人已降温至45。C左右 的经高压灭菌的MH琼脂14ml,轻轻摇匀,使琼脂与 抗菌药充分混匀,此时平板中的抗菌药被稀释了15 倍。最后在不含药的无菌对照和细菌生长对照平板 中各加人15ml的MH琼脂。②将过夜增菌的受试 菌稀释至107CFU/ml的菌液浓度,以多点接种仪蘸 取1ul的菌液接种于平板上，最终接种菌量为 10'CFU/点。置35C培养箱中孵育18~24h后观察 结果。
(三)结果判断
药物最低浓度无细菌生长者,即为该药物对受试 菌的MIC值(图4-1-3、图4-1-4)。
三、E试验E-test
(一)基本原理
E试条(产品名PDM epsilometer test)是一条宽 5 mm、长60mm的无活性塑料薄条,其表面标有以 pug/ml为单位的抗菌药物浓度MIC判读刻度,并标出 是何种抗菌药物,背面含有干化、稳定的浓度由高至 低连续梯度分布的抗菌药物,药物浓度按1g2梯度递 减。将E试条放至一个已接种细菌的琼脂平板时,其 载体上的抗菌药物迅速且有效地释放人琼脂,从而在 试条下方马上建立了一个抗菌药物浓度的连续梯度， 经孵育后,当细菌的生长清晰可辨时,即可见一个以 试条为中心的对称抑菌椭圆环,椭圆环边缘与试条的 交界处的刻度(以ug/ml为单位)即为MIC值。该方 法结合扩散法和稀释法的原理和特点,操作简便,得 到定量结果。常用于一般细菌、苛养菌、厌氧菌、分枝 杆菌、真菌的药敏试验。
(二)试验方法
菌液浊度和平板接种等同纸片扩散法(厌氧菌、 隐球菌和其他真菌菌悬液浓度为1麦氏单位,其他细 菌为0.5麦氏单位)。将E试条轻放在已接种细菌的 干燥后的琼脂平板上(90mm平板放置1~2条， 150mm平板可放置4~6条),刻度朝上,浓度最大处 靠边缘。置于一定条件下孵育:厌氧菌置于厌氧环 境孵育48h,苛养菌置于5%~10%CO，环境孵育24~48h,隐球菌孵育48~72h,其他细菌于空气中孵 育24h。
(三)结果判断
孵育后围绕着试条可形成一个椭圆形的抑菌圈， 抑菌圈与试条的横向相交处的读数刻度为MIC值 (图4-1-5)。
四、联合药敏试验Combination susceptibility test
联合应用抗菌药物的目的在于获得协同作用， 提高疗效,减少用药剂量,减轻毒性反应,防止或延 缓耐药菌株的产生。联合药敏试验的方法很多,如 肉汤稀释棋盘法、试管稀释棋盘法、琼脂稀释棋盘 法、单药纸片搭桥法、复合药物纸片法、纸条法等。 前两种方法的结果较为准确,但费时费材料，工作 量大;纸片、纸条法等简便易行,但有时结果不易 判断。
(一)纸片法
与纸片扩散法类似。先将受试菌菌液均匀涂布 于培养基表面,盖好平板,放置5min,待琼脂表面水 分被吸收后,将两种含药纸片贴于平板上。两纸片之 间以相距2~3cm为宜。37。C孵育过夜后判读结果。 结果判断:根据呈现的抑菌图形报告“协同”“相加” “无关”或“拮抗”作用(图4-1-6)。协同作用常常发生 在:①联合用药的两种抗菌药物是在不同部位抑制 细菌细胞壁合成或封闭细菌的新陈代谢;②B-内酰胺 类抗生素增加了氨基糖苷类药物进人细菌细胞;③联 合用药的抗菌药物之一是抑制B-内酰胺酶活性的酶 抑制剂。
(二)肉汤稀释棋盘法
是最常用的联合药敏试验之一。使用96孔无菌 微孔板,每种抗菌药物最高从2倍MIC浓度开始用 灭菌MH肉汤倍比稀释，一般取6~8个稀释度,各取 50pl分别排列在微孔板的行与列上，然后在无菌微孔板中加人100l菌液，最终接种菌量为5X 10'CFU/ml,孵育过夜后判读结果,无细菌生长的最 低药物浓度为MIC。通过计算部分抑菌浓度指数 (fractional inhibitory concentration, FIC)来判断相互 作用。根据FIC指数,抗菌药物联合应用后的作用有
4种类型:①协同作用,即两种抗菌药物联合后的活 性显著大于其单药抗菌活性的总和(FIC<0.5); ②相加作用,两种抗菌药联合后的活性等于其单药抗 菌活性的总和(0.5<FIC<1);③无关作用,两种抗 菌药物联合后的活性等于其单药抗菌活性(1<FIC< 2);④拮抗作用,两种抗菌药物联合后的活性显著低 于其单药抗菌活性,即一种抗菌药物的活性被另一种 抗菌药物削弱(FIC>2)。
